القاء موتانت های فاقد هسته یخ در جدایه های اپی فیت شبه viridiflava pseudomonas در مرکبات استان مازندران و مقایسه توالی ژن فعال هسته یخ در بین جدایه های آن

برخی از باکتری های بیماری زای قسمت های هوایی گیاهان، قابلیت عمل کردن به عنوان هسته یخ در دماهای 5/1 تا 9 درجه زیر صفر (5/1- تا 9-) را داشته و هر ساله خسارت های زیادی را در اثر یخ زدگی، به مزارع و باغات اکثر کشورهای دنیا وارد می سازند. تحقیق اخیر به منظور شناسایی ژن مسئول بیوسنتز پروتئین عامل یخ زدگی (ژن ice) در جدایه هایی از باکتری غالب در مرکبات و تعداد دیگری از میزبان ها در فصول خنک سال در مازندران و غیر فعال کردن ژن با روش های جهش زایی صورت گرفته است. از جدایه های باکتری به عنوان شبه pseudomonas viridiflava جدا شده از مرکبات استان مازندران موجود در آزمایشگاه باکتری شناسی گروه گیاه پزشکی دانشگاه علوم کشاورزی ومنابع طبیعی ساری، در این تحقیق استفاده شد. برای بررسی فعالیت هسته یخ این جدایه های از آزمون انجماد قطره ای استفاده شد. به منظور ردیابی ژن هسته یخ (ice nucleation active (ina)) در جدایه های فعال از نظر فنوتیپ هسته یخ، از آزمون واکنش زنجیره ای پلی مراز با چهار جفت پرایمر استفاده گردید. به دلیل عدم وجود توالی ژن مولد هسته یخ p. viridiflava در ncbi برای طراحی پرایمر، فرض شدکه ژن ina در p. viridiflava مشابه با ژن هسته یخ در p. syringae و p. fluorescence باشد. بنابراین دو نوع پرایمر inak و inaw از روی توالی ژن هسته یخp. syringae و p. fluorescence به ترتیب طراحی گردید و نوع سوم، به نام پرایمر inat از روی تطابق دو توالی ژن هسته یخ در p. syringae و p. fluorescence طراحی شد. طراحی پرایمر چهارم (inac) برای ژن هسته یخ جدایه های این باکتری، بر اساس توالی نواحی حفظ شده در چندین گونه از باکتری های مولد هسته یخ صورت گرفت. سه نوع پرایمر اول در واکنش زنجیره ای پلی مراز مورد استفاده قرار گرفتند و در برخی از جدایه ها تولید باند نمودند که نشانگر شباهت ژن هسته یخ در این جدایه ها با ژن هسته یخ در p. syringae و p. fluorescence بود. ولی در پرایمر نوع چهارم تعداد بیشتری از جدایه های باکتری دارای باند مورد نظر بودند. پس از انجام pcr با بکارگیری جفت پرایمر inac و مشاهده باند مورد انتظار یکی از جدایه های باکتری (جدایه 510)، توالی یابی گردید. blast توالی ina باکتری مورد نظر در ncbi انجام گرفت و تشابه آن با ژن ina در سایر باکتری ها بررسی شد. یکی از روش های بکار رفته برای ایجاد جهش در ژن ina در دو جدایه از باکتری (101 و 510)، استفاده از ترانسپوزون tn5 دارای ژن مقاومت به کانامایسین کلون شده در پلاسمید pbsl118 بود. انتقال پلاسمید به سلول های باکتری به کمک الکتروپوریشن با اختلاف پتانسیل v 1700 و فاصله بین دو الکترود 1 میلی متر انجام شد. تیمار دو جدایه ina + با ماده ی جهش زای ems، با دو غلظت 20 و 25 میکرولیتر در میلی لیتر نیز برای ایجاد جهش استفاده گردید. ردیابی ژن ina در جهش یافته ها، با واکنش زنجیره ای پلی مراز با جفت پرایمر inac صورت گرفت. برای ارزیابی جهش یافته ها و تأثیر آن ها روی گیاه، سوسپانسیون کدری (جذب بیش از 5/0 واحد در 600 نانومتر) از هر جهش یافته روی گیاهچه های 6 تا 8 برگی پرتقال محلی پاشیده شد و گیاهچه ها به مدت 7 تا 10 ساعت در دمای حدوداً 9- تا 10- درجه سلسیوس نگهداری و سپس به گلخانه بازگردانده شدند. پنج کلونی از جهش یافته ها نتوانستند روی گیاهچه ها علائم سرمازدگی را ایجاد کنند. ولی یکی از کلونی های جهش یافته علائم خفیف سرمازدگی را توانست القاء نماید. سایر جهش یافته ها علائمی مشابه و یا همسان با جدایه مادری را نشان دادند.